Chip-seq实验

  • 概念
    • Chip-seq(Chromatin Immunoprecipitation,CHIP)研究体内蛋白质和DNA相互作用的工具，用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究
    • OCRs:染色质可及区域，大多数dna多次缠绕形成染色体，但一些dna仅和组蛋白形成核小体，部分dna不与组蛋白结合形成开放区域。DNA复制和转录通常发生在开放区域，并且TF与开放区域结合可以达到调控下游基因。
    • 顺式作用元件：在同一条核苷酸链上起调控基因作用的核酸序列，顺式作用元件本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。类型：Promoter，enhancer，silencer，insulator
    • 反式作用因子(TF)：指和顺式作用元件结合的可扩散性蛋白，包括基础因子，上游因子，诱导因子。

      • 转录因子（Transcription factor，TF）是能够结合在某基因上游5’端特异序列上的蛋白质，它作为反式作用因子，与真核基因的顺式作用元件比如启动子、增强子等发生特异性相互作用，从而激活或者抑制基因的转录。

      • TF

    • 顺式作用元件件在分子遗传学领域，相对同一染色体或DNA分子而言为“顺式”（cis）；对不同染色体或DNA分子而言为“反式”（trans）

  • Chip-seq意义
    • 本质是染色质免疫共沉淀+二代测序
    • 两大类应用——TF ChIP 和Histone ChIP
      • TF Chip-seq:用来确定靶蛋白也就是转录因子是否结合特定基因组区域（如启动子或其它DNA结合位点）。
      • Histone Chip-seq:确定组蛋白修饰相关的特定位点，还可以确定组蛋白修饰酶类的靶标
        • 为什么组蛋白容易被修饰?

          组蛋白N端有一段富含赖氨酸和精氨酸的“尾巴”，尾巴上的氨基酸可以被修饰酶催化添加各种修饰基团，如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化等等，这个过程就称为组蛋白修饰。在表观遗传中，组蛋白修饰对基因表达的调控非常非常重要，最常见的组蛋白修饰就是甲基化和乙酰化

        • 组蛋白的修饰有什么影响？

          组蛋白乙酰化与染色质的开放和转录激活相关
          组蛋白甲基化修饰有不同的修饰类型和氨基酸，既可以激活转录（如H3K4me3、H3K36me3、H3K79me3等），也可以抑制转录（如H3K9me3、H3K27me3等）。

  • Chip-seq实验流程
    实验流程
    1. DNA与蛋白质交联
    2. 染色体片段化处理
    3. 免疫沉淀
    4. DNA解交联及纯化
    5. 测序数据分析

数据分析使用工具(使用bioconda下载 conda install -r bioconda)

  • sra-tools:操作SRA（reads and reference alignments）数据的工具集，用于从SRA文件中提取fastq文件
  • bowtie2：将短序列比对导模板基因组的工具，擅长将50-100bp的比对
  • samtools：用于SAM格式后处理对齐的程序。

    SAM格式是序列比对之后的输出格式
    BAM文件是SAM文件的二进制

  • picard:在BAM或SAM文件中查找并标记重复读取？？
  • macs2：用于call peaks来确定dna和蛋白质互作的位点
  • deeptool：可视化格式转化工具
  • ROSE（上官网wget下载压缩包）：通过bam文件以及gff文件寻找enhancer及其相关基因的工具

Chip-seq pipline流程

  • Chip-seq数据处理流程
  1. 下载Chip-seq原始数据
  2. 下载人类参考基因组并建立index
  3. 使用bowtie2比对：fastq文件中相邻read之间没有位置关系。在建库和测序之后，read完全被打乱。将read和参考基因组比较，并把每一条read在参考基因组上定位，按fastq的顺序排好
  4. PCR去重复
  5. Peak calling：查找DNA结合位点，使用MACS获得Chip-seq富集区
  6. 使用IGV工具进行可视化
  7. 使用ROSE筛选super-enhancer

Single-end和Paired-end区别[参考文章]
区分

  • Single-end:首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段，引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在flow cell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列
    • 特点：只有一种测序引物 ，使得PCR只能沿着这个引物的方向进行，所有的 reads 都只能按照一个方向进行读取
    • 问题：测序的质量会随着测序的进行而下降，所以 reads 约往后面越不准确
  • Pair-end:指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-End Module)引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序
    • 特点：从DNA片段的两端进行读取，分别读取超过一半再通过重合部分进行拼接
    • 测序方向示意图：测序
    • 拼接示意图：拼接